肽酶激活型荧光探针的设计、合成及应用

【摘要】：肽酶作为一类响应细胞反应的多肽水解酶,广泛存在于动物、植物以及微生物体内,参与营养摄取、信号传导、细胞分化、成熟以及凋亡等生理过程。恶性肿瘤的发生、发展和转移常伴随此类酶的过度表达。在肠道微生物菌群中,肽酶也表现出明显的活性差异。近年来,借助于荧光成像技术灵敏度高、特异性强、生物相容性好以及非侵入性等优势,探究肽酶在生物体内的生理学或病理学功能,逐渐成为研究的热点。本论文基于具有大斯托克斯位移和近红外荧光发射性质的荧光团(E)-2-[3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环-2-烯-1-亚基]丙二腈ADM,设计、合成三例肽酶激活型荧光探针,进行了酶功能评估、疾病诊断、微生物垂钓以及抑制剂筛选等方面的研究工作。基于二肽基肽酶Ⅳ(DPPIV)的代谢特性,合成一例荧光探针GP-DM,实现了体外、体内DPPIV活性的精确和动态监测。表型反应和抑制实验表明,该探针对DPPIV具有优于其它丝氨酸水解酶的代谢活性和对生物基质的强抗干扰能力。GP-DM除了可用于多种生物样本(血浆、组织微粒体)和肿瘤细胞中DPP IV活性进行评估外,还可对荷瘤小鼠和斑马鱼实现实时成像。并由此发现,DPPIV的存在与癌细胞的迁移和增殖密切相关,或可通过抑制其活性进行癌症治疗。鉴于γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)在维持细胞内氧化还原平衡方面的重要作用,将其作为细菌体内激活靶酶,合成了一例荧光探针ADMG。利用该探针对小鼠肠道进行成像,发现肠道中γ-GT高表达细菌主要分布于十二指肠;并对十二指肠中的细菌菌落进行垂钓,分离出荧光强度较高的菌落,结合16S DNA测序技术鉴定,得到三种γ-GT高表达细菌,分别是肺炎克雷伯菌CAV1042、肺炎克雷伯菌XJRML-1和粪肠球菌。依据高表达功能酶进行肠道细菌分选,为混合菌株的快速识别提供了一种新思路。以L-焦谷氨酸作为识别基团,构建一例检测焦谷氨酸肽酶(PGP-1)的荧光探针ADMP。利用该探针对74种天然产物进行高通量筛选,获得了四种PGP-1抑制剂,分别是甲萘醌、土木香内酯、木香烯内酯和鼠尾草酸。随后,将ADMP用于人粪便中微生物组垂钓,得到PGP-1高表达细菌和真菌;经基因测序鉴定,细菌为肺炎克雷伯菌1557,真菌为星形毛孢子菌。并对纯化后的两种微生物进行荧光成像与流式细胞分析,证明了 ADMP用于内源性PGP-1检测的可靠性和抑制剂筛选的实用性,进一步说明利用荧光成像可有效提高微生物识别效率。