大白菜叶片和叶球发育相关性状的QTL及候选基因鉴定

【摘要】：大白菜(Brassica rapaL.ssp.Pekinensis,AA)属于十字花科芸薹属芸薹种,是我国重要的蔬菜作物。叶球是大白菜的主要食用部位,叶片及叶球发育相关性状直接关系到大白菜的产量和商品性。目前,针对大白菜叶片和叶球发育相关性状开展QTL定位的报道逐渐增多,研究多集中在叶长、叶宽、球高和球重等性状,且主要采用SSR和InDel等传统分子标记,构建的遗传图谱密度较低,定位区间大部分大于5 cM,无法明确具体功能基因。全基因组信息显示叶片极性发育和生长素相关基因与大白菜形态发育有关,但对控制叶球抱合类型的候选基因鉴定还鲜见报道。因此,有必要基于高通量测序技术构建大白菜高密度遗传图谱,对叶片和叶球发育相关性状的QTL及其候选基因进行鉴定,为大白菜叶片和叶球发育相关基因的挖掘提供参考。本研究利用大白菜全基因组序列信息,在全基因组水平鉴定SSR位点,获得大白菜叶片近-远轴极性建成基因的特异SSR,分析其序列变异和分布特点;以叠抱结‘14Q-141’和舒心结球‘14Q-279’构建的大白菜F2群体(CCF2)、普通不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)‘PC-101’和结球大白菜‘CC-48’为亲本构建的F2群体(PCCCF2)为试材,分析19个叶片和10个叶球发育相关性状的遗传变异位点,分别使用WGS(Whole Genome Resequencing,全基因组重测序)和GBS(Genotyping-by-Sequencing,简化基因组测序)方法构建高密度SNP遗传图谱,结合混池测序技术,鉴定叶片和叶球发育相关性状的QTL及其候选基因,针对筛选出的候选基因BrARF3.1开展基因功能验证研究,分析过表达转基因植株的转录调控方式。本研究旨在检测调控大白菜叶片和叶球发育相关性状的主要染色体区域,发掘与QTL共分离的候选基因,揭示主要候选基因的表达调控模式,为解析大白菜叶片和叶球发育的分子机制奠定理论基础,有利于定向培育不同结球类型的大白菜新品种。获得的主要结果如下:1.大白菜全基因组水平共检测出173,892个SSR位点,以P型(完全重复类型)为主,一至三个核苷酸重复基元的密度显著高于四至六个核苷酸重复基元的密度,且碱基组成以富含A、T的重复基元为主。在41个大白菜叶片近-远轴极性建成基因中,开发获得基因特异的SSR位点341个,利用多态性高的特异SSR引物23对,以及随机SSR引物、SNP引物和InDel引物127对,以CCF2群体为材料,获得了一张具有150个分子标记、包含10个连锁群的遗传图谱框架图,总长度为1747.57 cM。2.以CCF2群体为材料,基于WGS测序构建了一张含有2,904个SNP标记的遗传图谱,总长度为1,399.44 cM,标记间平均距离为0.48 cM。在2016和2017年,共检测到控制6个叶片发育相关性状的QTL位点1 1个,控制7个叶球发育相关性状的QTL位点23个,分布于10个连锁群。其中,叶片发育相关性状的主效QTL位点1个,即控制球叶叶柄面积的QTL位点,表型变异解释率为14.5%;叶球发育相关性状的主效QTL位点6个,分别为控制叶球抱合类型、球高和球重的位点,可解释10.7%～17.5%的表型变异。两年共定位的控制叶球抱合类型的QTL位点位于A04染色体6.44～7.14 Mb区域。发现与8个叶片及叶球发育相关性状的QTL区域共分离的候选基因1 1个:与叶片发育相关性状QTL共分离的候选基因5个,分别为BrAS1、BrROT4、BrCycD3;3、BrKRP2、BrAN3;与叶球发育相关性状QTL共分离的候选基因 6 个,分别为 BrPKL、BrPFL2、BrGA20OX3、BrPHV、BrCOW1、BrCycD3;1。3.以PCCCF2群体为材料,基于GBS构建了一张含有3,194个SNP标记的遗传图谱,总长度为1,522.89 cM,标记间平均距离为0.48 cM。共检测到控制6个叶片发育相关性状的QTL位点15个,控制4个叶球发育相关性状的QTL位点13个,分布于5个连锁群A04、A05、A06、A08、A09上。其中,叶片发育相关性状的主效QTL位点4个,分别为控制整株面积、株高、外叶长和外叶叶柄长的QTL位点,可解释14.5%～21.6%的表型变异;叶球发育相关性状的主效QTL位点5个,分别为控制叶球抱合类型、结球性、叶球重和总重的QTL位点,可解释11.0%～17.6%的表型变异。共检测到与12个QTL区域共分离的候选基因21个,与控制叶片发育相关性状QTL共分离的候选基因10个,与控制叶球发育相关性状QTL共分离的候选基因15个,涉及叶片和叶球发育相关性状共同的候选基因4个,分别为BrARF3、BrYAB1、BrHST、BrANT1。混池分析发现控制叶球抱合类型的候选基因9个,与QTL定位中均发现控制叶球发育相关性状的候选基因BrARF3、BrARL和BrANT1。4.CCF2群体的QTL定位和PCCCF2群体的混池分析中,均发现与控制叶球抱合类型QTL共分离的候选基因BrGA20OX3,主要调控赤霉素的生物合成。5.对不结球白菜和大白菜的BrARF3.1基因进行克隆,二者在CDS序列1563处发生了 C/G碱基突变,与CCBrARF3.1序列相比,PCBrARF3.1的第521个氨基酸处氨基酸Gln替换成His。将过表达基因PCBrARF3.1和CCBrARF3.1分别转入不结球白菜中,转基因阳性植株均表现为结球,转录组分析发现9个叶球发育相关性状的候选基因差异表达明显,在过表达转基因植株中BrAS2、BrREV、BrSGS3、BrAS1、BrARF3和BrAGO1上调表达,BrRDR6、BrKRP2和BrARGOS下调表达。