茄子突变体dwf矮化候选基因鉴定及差异表达基因分析

【摘要】：茄子(Solanum melongena L.)属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum),中国的种植面积和总产量均居世界第一。茄子属无限生长型,株高作为茄子育种的主要目标性状之一,与植株抗倒伏、产量、轻简化栽培管理等有密切关系,创制矮化资源是实现上述目标品种改良和开展矮化机制研究的重要途径。本研究从圆茄自交系‘14-345’(WT,wildtype)EMS突变体库M2代筛选出明显矮化的突变植株,经自交获得纯合的矮化突变体dwf和株高性状分离的M3群体,以dwf和WT为亲本杂交获得F1,F1自交得到F2分离群体。通过研究上述材料表型性状,分析矮化性状遗传规律;以M3和F2分离群体为试材进行BSA(bulk segregant analysis)重测序,鉴定矮化突变的候选基因;对dwf和WT四叶一心和六叶一心两个时期进行RNA-Seq分析,在基因表达水平揭示茄子矮化突变机理;对dwf和WT的内源激素含量、叶绿素含量及光合特性等的研究,从生理水平阐释矮化机理。旨在发掘茄子矮化基因,探索茄子矮化突变的作用机制,为茄子及茄果类矮化研究提供新的种质材料和方法。1.与WT相比,突变体dwf植株矮小,株高、节间长度、叶面积和节间细胞长度等均极显著小于WT,节间细胞缩短可能是植株矮化的主要原因。与野生型的“假二叉型”分枝表现不同,dwf的分枝能力增强,主茎不明显,表现出多分枝特性;dwf与WT杂交后代F1株高表型与野生型一致,F2中株高表现为野生型性状与矮化型性状分离比符合3:1,说明矮化性状受隐性单基因控制。2.M3和F2分离群体的BSA重测序发现,M3群体中候选非同义突变82个和终止突变8个,F2群体中非同义突变13个和终止突变2个。结合两个群体的共同SNP突变位点信息,筛选出候选基因Sme2.5_01158.1_g00001.1,该基因CDS序列全长为3912bp,具有三个保守结构域。在第一个外显子核苷酸序列8216处,由G突变为A,编码的氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸,该基因功能为编码NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR1)蛋白,可能是矮化突变候选基因,命名为SmCPR1。经KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)验证和Sanger测序进一步证实了 BSA测序结果。3.在六叶一心期,矮化突变体dwf叶绿素b和叶绿素a+b含量极显著高于WT,叶绿素a/b极显著低于WT,叶绿素a含量无差异。定植后30d,矮化突变体dwf和WT的叶绿素含量、叶绿素荧光参数及光合特性等均无显著差异。4.RNA-Seq结果表明,四叶一心期的矮化突变体dwf和WT共有7859个差异表达基因(DEGs),其中上调基因4002个,下调基因3857个;六叶一心期的矮化突变体dwf和WT共有差异表达基因3572个,其中上调基因1798个,下调基因1774个。两个时期共同上调的通路除植物激素信号转导外,主要集中在物质合成、代谢方面,下调通路多与细胞组分有关。KEGG富集分析发现,与矮化及抗性相关的主要通路是植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、植物-病原体互作和MAPK信号。BR(油菜素内酯)信号转导通路中,编码细胞分裂蛋白CYCD3的3个基因Sme2.5_00038.1_g00008.1、Sme2.5_01333.1_g00008.1和 Sme2.5_02838.1_g00002.1均表现下调。转录因子WRKY33、植物-病原互作以及茉莉酸(JA)合成途径的关键基因显著上调表达,可能共同影响矮化突变体dwf的抗性。5.对四叶一心(A)、五叶一心(B)、六叶一心(C)和七叶一心(D)四个时期的内源激素含量检测发现,矮化突变体dwf中,BR在A、B、D三个时期极显著或显著低于WT;GA3在四个时期均显著或极显著低于WT;IAA在A和D时期极显著高于WT;ABA在B时期极显著低于WT,C时期却极显著高于WT;ZR在A时期极显著高于WT,其他时期与WT无显著差异。6.结合RNA-Seq分析激素调控机理发现,BR合成通路中编码关键蛋白Det2的基因Sme2.5_15483.1_g00001.1在四叶一心期下调表达,限制了早期和晚期的C6氧化过程和早期C22向C6途径的转化,影响BR合成。该基因在六叶一心期表达无差异,与BR含量测定表现一致。GA合成通路编码GA2ox的3个基因Sme2.5_04516.1_g00001.1,Sme2.5_00108.1_g00003.1 和 Sme2.5_01907.1_g00015.1 上调表达,促使赤霉素失活导致矮化突变体dwf的GA3含量显著或极显著低于WT。编码ABA合成酶Crtz的基因Sme2.5_01586.1_g00008.1在四叶一心期表达上调,但从黄氧素向ABA转化过程中基因Sme2.5_01807.1_g00005.1在四叶一心期下调表达,抑制了 ABA的转化效率,导致黄氧素积累,可能在一定程度上影响了植株生长,到六叶一心期Sme2.5 01807.1_g00005.1变为上调表达,促进了 ABA的合成,因此dwf中ABA含量在六叶一心期急剧升高;ZR合成的关键酶IPT的编码基因Sme2.5_05513.1_g00004.1在四叶一心期上调表达,使dwf的ZR含量在四叶一心期显著高于WT;IAA合成通路3条途径上的部分基因在四叶一心期和六叶一心期表达不同,IAA合成可能是受基因表达量的累积效应影响。